第358章 将军与公主（番外）（2 / 2）
利用生物大分子之间相互作用的基因克隆方法。
5、什么是基因文库？基因文库有哪两类？
6、用于植物遗传转化的生物载体有哪两类？
（1）病毒载体：
?单链RNA植物病毒
?单链DNA植物病毒
?双链DNA植物病毒
（2）质粒载体：
?Ti质粒（根瘤土壤杆菌）
?Ri质粒（毛根土壤杆菌）
7、根癌农杆菌为何能诱发植物冠瘿瘤形成？
8、Ti质粒的主要结构区域和功能。
（1）毒性区（vir区）：激活TT－DNA的转移
（2）T－DNA区：侵染植物时，从Ti质粒上被切割，转移到植物细胞中，带有与肿瘤形成
有关的基因
（3）质粒接合转移区（区）：存在与细菌间进行接合有关的基因
（4）质粒复制起始区（Ori区）：保证Ti质粒进行自我复制。
（5）冠瘿碱分解位点
9、T-DNA的结构和功能。
结构：（1）一般在23kb左右，都含有一段8kb左右的核心区（2）在T-DNA的5’端和3’端都有真核表达信号，如TATA-box、AATAA-box及poly(A)n等（3）无内含子（4）含致瘤基因（激素合成有关的基因）（5）含冠瘿碱合成代谢基因（6）左边界、右边界（RBandLB)序列（对T-DNA转移的重要性：右边界更保守）
功能：侵染植物时，从Ti质粒上被切割，转移到植物细胞中，带有与肿瘤形成
有关的基因
Vir区的主要结构和功能。
总长度大约35kb，由7个互补群组成，分别命名为VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG和VirH
VirA
结构：单一基因，2.8kb，编码1条92kDa的多肽，为一种结合在膜上的受体蛋白（周质结构域，接头结构域，激酶结构域，接收器结构域）；VirA蛋白C端保守区可以进行ATP特异性自发磷酸化（磷酸化的位点在474位组氨酸残基上，形成稳定的1-磷酸组氨酸和3-磷酸组氨酸）；磷酸化的VirA蛋白能激活VirG蛋白（通过转移其磷酸基团至VirG蛋白的一个天冬氨酸残基）
功能：帮助植物细胞接受植物信号分子，启动毒性区表达
VirG
结构：1.2kb，为单拷贝基因，编码DNA结合活化蛋白；位于VirG蛋白N端第52位的天冬氨酸可以被磷酸化形成酰基磷酸（VirG蛋白必须在VirA蛋白存在下才能够特异性地
磷酸化）
功能：转录因子。可以特异地结合到VirB、C、D、E、G和H操纵子的5’端非转录区，激活转录
VirB
结构：至少编码11个开放阅读框架，编码膜转运蛋白。
蛋白质的N端带有信号序列。这种序列可以帮助蛋白质在膜上的运输，使其独立地或借助类似分子伴侣受体的帮助穿过内膜。
功能：可能是通过改变细菌细胞膜的结构，产生一个膜穿透通道，使T-DNA转移到细菌细胞外；也可能作为T-DNA复合物的组成成分。
VirC
功能：VirC1可以和T-DNA末端序列外侧的增强驱动子序列结合。可以提高土壤农杆菌的致瘤性（通过提高VirD操纵子在T-DNA末端序列特异位点的缺刻式切割能力来实现）；VirC2的功能目前尚不清楚。
VirD基因家族（1-4）
分别编码分子质量约为16.2、47.4、21.3和5.8kDa的四种不同的蛋白质分子，均与T-DNA加工有关。
VirD1：编码一种DNA松驰酶。
VirD2：①具N端的T-DNA末端切割能力；②含有核定位信号。VirD2与T-DNA共价结合后，可以引导复合物向植物细胞核方向运动。
VirD3：功能尚不清楚。不同类型的农杆菌菌种之间VirD3蛋白的同源性很小。
VirD4：N端带有一段信号肽序列，引导蛋白转运到细胞内膜。
VirE
编码的VirE2蛋白质是一种单链DNA结合蛋白。
功能：VirE2以共价的方式与经过加工的T-DNA分子的5’末端结合，形成T-复合物，以保护其免受核酸酶的降解。
VirF
可能的功能：协助T-DNA转移到宿主植物细胞中
VirH
功能：可能对植物产生的某些杀菌或者抑菌化合物起解毒作用，从而使农杆菌的生长不受这些物质的抑制
Tzs
编码与玉米素有关的细胞分裂素异戊（间）二烯基转移酶，可将玉米素分泌到细胞外（玉米素能促进农杆菌感染部位的植物组织脱分化和细胞分裂）
T-DNA整合到植物核基因组的必要条件。
（1）T-DNA边界序列
（2）Vir区基因
（3）农杆菌染色体上的基因
12、共整合载体系统的工作原理。
（1）农杆菌和大肠杆菌两个质粒具有一同源区
（2）两个质粒接合后经过同源重组形成一个大的共整合质粒
（3）将欲导入植物的外源基因在大肠杆菌中进行克隆和操作，与农杆菌Ti质粒同源重组后，此外源基因就定位于两个T-DNA边界序列之间
（4）大肠杆菌质粒不能在农杆菌中进行自主复制，所以不经过重组就无法在农杆菌中稳定存在
13、双元载体系统的工作原理。
（1）有辅助质粒和穿梭质粒组成
（2）辅助质粒：含有为T-DNA转移所必须的Vir区段，提供毒性基因功能；含有农杆菌复制起始子；没有T-DNA边界序列。
（3）穿梭质粒：具有1-2个T-DNA边界重复序列；广谱寄主范围复制功能和移动功能；细菌选择标记，如卡那霉素抗性基因；最近构建的穿梭载体携带有sI复制起始子(来自
pBR322)，所以可大量制备质粒；编码植物选择标记、表达信号，T-DNA边界序列；有用于外源基因亚克隆的多克隆位点
（4）两种质粒在单独存在的情况下都不具备诱发肿瘤的功能
（5）接合后，两个质粒在选择压下可以自主共存于同一农杆菌细胞中。当农杆菌感染受伤的植物时，Ti质粒上的Vir基因与穿梭质粒上的右边界序列发生反式相互作用，从而将T-DNA转移进入植物细胞。
14、比较共整合载体系统和双元载体系统的特点。
共整合载体系统：
双元载体系统：（1）由两个彼此相容的质粒组成，两个质粒可以自主共存在同一农杆菌细胞中（基本特点）
（2）不需体内重组
（3）仅需将一个质粒转入细菌